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वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर सिद्धांत तकनीक और अनुप्रयोग

वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर एक फ्लोरोफोर का उपयोग करके डीएनए प्रवर्धन प्रतिक्रिया में प्रत्येक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) चक्र के बाद उत्पाद की कुल मात्रा को मापने की एक विधि है।विधि का उपयोग आंतरिक या बाहरी संदर्भ विधियों द्वारा परीक्षण किए जाने वाले नमूने में विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों को मापने के लिए किया जाता है।अपनी स्थापना के बाद से, फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर परख प्रयोगशाला शिक्षकों के साथ तेजी से लोकप्रिय हो गए हैं।

फ्लोरेसेंस पीसीआर सिद्धांत: फ्लोरेसेंस पीसीआर, जिसे पहले टैक्मैनपीसीआर कहा जाता है और बाद में रियल-टाइमपीसीआर भी कहा जाता है, 1995 में यूएसए में पीई (पर्किनएल्मर) द्वारा विकसित एक नई न्यूक्लिक एसिड क्वांटिफिकेशन तकनीक है। यह तकनीक फ्लोरोसेंटली लेबल वाली जांच या संबंधित को जोड़ने पर आधारित है। अपने मात्रात्मक कार्य को प्राप्त करने के लिए पारंपरिक पीसीआर के लिए फ्लोरोसेंट डाई।सिद्धांत: जैसे ही पीसीआर प्रतिक्रिया आगे बढ़ती है, पीसीआर प्रतिक्रिया उत्पाद जमा होते हैं और फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता समान अनुपात में बढ़ जाती है।प्रत्येक चक्र के साथ, एक प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेत एकत्र किया जाता है ताकि हम प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन द्वारा उत्पाद की मात्रा में परिवर्तन की निगरानी कर सकें और इस प्रकार एक प्रतिदीप्ति प्रवर्धन वक्र ग्राफ प्राप्त कर सकें।

वास्तविक समय प्रतिदीप्ति3
रीयल-टाइम प्रतिदीप्ति2

सामान्य तौर पर, प्रतिदीप्ति प्रवर्धन वक्र को तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है: प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि संकेत चरण, प्रतिदीप्ति संकेत घातीय प्रवर्धन चरण और पठार चरण।पृष्ठभूमि संकेत चरण के दौरान, प्रवर्धित प्रतिदीप्ति संकेत प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि संकेत द्वारा नकाबपोश होता है और उत्पाद की मात्रा में परिवर्तन निर्धारित नहीं किया जा सकता है।पठार चरण में, प्रवर्धन उत्पाद अब तेजी से नहीं बढ़ता है, अंतिम उत्पाद राशि और प्रारंभिक टेम्पलेट राशि के बीच कोई रैखिक संबंध नहीं है, और प्रारंभिक डीएनए प्रतिलिपि संख्या की गणना अंतिम पीसीआर उत्पाद राशि के आधार पर नहीं की जा सकती है।केवल फ्लोरोसेंट सिग्नल के घातीय प्रवर्धन चरण में पीसीआर उत्पाद राशि के लघुगणक और प्रारंभिक टेम्पलेट राशि के बीच एक रैखिक संबंध होता है, और हम इस स्तर पर इसे निर्धारित करना चुन सकते हैं।परिमाणीकरण और तुलना की सुविधा के लिए, दो बहुत महत्वपूर्ण अवधारणाओं को वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर तकनीक में पेश किया गया है: फ्लोरेसेंस थ्रेशोल्ड और सीटी मान।

थ्रेशोल्ड प्रतिदीप्ति प्रवर्धन वक्र पर एक कृत्रिम रूप से निर्धारित मान है।पीसीआर प्रवर्धन का घातीय चरण।

सीटी मान: चक्रों की संख्या है कि प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूब में प्रतिदीप्ति संकेत सेट डोमेन मान तक पहुंचने के लिए आया है।

सीटी मान और प्रारंभिक टेम्पलेट के बीच संबंध: अध्ययनों से पता चला है कि प्रत्येक टेम्पलेट के सीटी मान का उस टेम्पलेट की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या के लघुगणक के साथ एक रैखिक संबंध है, प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या की जितनी अधिक प्रतियां, उतनी ही छोटी सीटी मूल्य।सीटी मान अपेक्षाकृत स्थिर हैं।एक ज्ञात प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या के साथ एक मानक का उपयोग करके एक मानक वक्र बनाया जा सकता है, जहां क्षैतिज समन्वय प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या के लघुगणक का प्रतिनिधित्व करता है और लंबवत समन्वय सीटी मान का प्रतिनिधित्व करता है जैसा कि नीचे दिए गए चित्र में दिखाया गया है।

इसलिए, किसी अज्ञात नमूने का सीटी मान प्राप्त करके, उस नमूने की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या की गणना मानक वक्र से की जा सकती है।

सीटी मान स्थिर नहीं है और विभिन्न नमूनों और विभिन्न उपकरणों से प्रभावित हो सकता है, भले ही एक ही नमूना एक ही उपकरण पर 2 बार दोहराया जाता है, सीटी मान भिन्न हो सकता है।

मात्रात्मक प्रतिदीप्ति परख: मात्रात्मक प्रतिदीप्ति परख को इस्तेमाल किए गए मार्करों के आधार पर फ्लोरोसेंट जांच और फ्लोरोसेंट रंगों में विभाजित किया जा सकता है।फ्लोरोसेंट जांच में बीकन प्रौद्योगिकी (अमेरिकन टैगी द्वारा प्रतिनिधित्व आणविक बीकन प्रौद्योगिकी), ताकमान जांच (एबीआई द्वारा प्रतिनिधित्व) और एफआरईटी प्रौद्योगिकी (रोश द्वारा प्रतिनिधित्व) शामिल हैं;फ्लोरोसेंट रंगों में संतृप्त फ्लोरोसेंट रंग और गैर-संतृप्त फ्लोरोसेंट रंग शामिल हैं, गैर-संतृप्त फ्लोरोसेंट रंगों का विशिष्ट प्रतिनिधि SYBRGreen I है, जो आमतौर पर अब उपयोग किया जाता है;संतृप्त गैर-संतृप्त फ्लोरोसेंट रंगों का विशिष्ट प्रतिनिधि SYBRGreenⅠ है;संतृप्त फ्लोरोसेंट डाई हैं ईवाग्रीन, एलसीग्रीन, आदि।

SYBRGreenI फ्लोरोसेंट पीसीआर के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला डीएनए बाइंडिंग डाई है, जो गैर-विशेष रूप से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को बांधता है।अपनी मुक्त अवस्था में, SYBRGreenI एक कमजोर प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है, लेकिन एक बार डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए के लिए बाध्य होने पर, इसकी प्रतिदीप्ति 1000 गुना बढ़ जाती है।इसलिए, एक प्रतिक्रिया द्वारा उत्सर्जित कुल प्रतिदीप्ति संकेत मौजूद डबल-फंसे डीएनए की मात्रा के समानुपाती होता है और प्रवर्धन उत्पाद बढ़ने पर बढ़ता है।

डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए बाइंडिंग डाई के लाभ: सरल प्रयोगात्मक डिजाइन, केवल 2 प्राइमरों की आवश्यकता, जांच डिजाइन करने की कोई आवश्यकता नहीं, कई जीनों के तेजी से परीक्षण के लिए कई जांचों को डिजाइन करने की आवश्यकता नहीं है, पिघलने बिंदु वक्र विश्लेषण करने की क्षमता, विशिष्टता का परीक्षण प्रवर्धन प्रतिक्रिया, कम प्रारंभिक लागत, अच्छी व्यापकता और इसलिए आमतौर पर देश और विदेश में अनुसंधान में उपयोग किया जाता है।

फ्लोरोसेंट जांच विधि (ताकमान तकनीक): जब पीसीआर प्रवर्धन किया जाता है, तो एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्राइमर की एक जोड़ी जोड़ी जाती है।जब जांच बरकरार रहती है, तो रिपोर्टर समूह द्वारा उत्सर्जित फ्लोरेसेंस सिग्नल बुझे हुए समूह द्वारा अवशोषित कर लिया जाता है और पीसीआर उपकरण द्वारा इसका पता नहीं लगाया जाता है;पीसीआर प्रवर्धन (विस्तार चरण में) के दौरान, टाक एंजाइम की 5'-3' दरार गतिविधि एंजाइमी रूप से जांच को नीचा दिखाती है, जिससे रिपोर्टर प्रतिदीप्ति समूह और बुझती प्रतिदीप्ति समूह बन जाता है।

फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर के अनुप्रयोग।

आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान:

1. मात्रात्मक न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण।संक्रामक रोगों का मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण, रोगजनक सूक्ष्मजीवों या वायरस का पता लगाना, जैसे कि हाल ही में इन्फ्लूएंजा ए (H1N1) महामारी, ट्रांसजेनिक पौधों और जानवरों की जीन कॉपी संख्या का पता लगाना, आरएनएआई जीन निष्क्रियता दर का पता लगाना, आदि।

2. विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण।उपचारित नमूनों (जैसे दवा उपचार, शारीरिक उपचार, रासायनिक उपचार, आदि) के बीच जीन अभिव्यक्ति अंतर की तुलना, विभिन्न चरणों में विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति अंतर और सीडीएनए माइक्रोएरे या अंतर अभिव्यक्ति परिणामों की पुष्टि

3. एसएनपी का पता लगाना।एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं का पता लगाना विभिन्न रोगों के लिए व्यक्तिगत संवेदनशीलता या विशिष्ट दवाओं के लिए व्यक्तिगत प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, और आणविक बीकन की सरल संरचना के कारण, एक बार एसएनपी की अनुक्रम जानकारी ज्ञात होने के बाद, यह आसान और सटीक है उच्च-थ्रूपुट एसएनपी का पता लगाने के लिए इस तकनीक का उपयोग करें।

4. मिथाइलेशन का पता लगाना।मिथाइलेशन कई मानव रोगों, विशेष रूप से कैंसर से जुड़ा हुआ है, और लैयर्ड ने मिथाइललाइट नामक एक तकनीक की सूचना दी, जो प्रवर्धन से पहले डीएनए का इलाज करती है ताकि अनमेथिलेटेड साइटोसिन यूरैसिल बन जाए और मिथाइलेटेड साइटोसिन अप्रभावित हो, मिथाइलेटेड और अनमेथिलेटेड डीएनए के बीच अंतर करने के लिए विशिष्ट प्राइमर और टैकमैन जांच का उपयोग करते हुए। .अधिक संवेदनशील।

चिकित्सा अनुसंधान:

1. प्रसव पूर्व निदान: लोग परिवर्तित आनुवंशिक सामग्री के कारण होने वाली वंशानुगत बीमारियों का इलाज नहीं कर सकते हैं, और अब तक, वे विभिन्न वंशानुगत बीमारियों की घटना को रोकने के लिए जन्म के पूर्व निगरानी के माध्यम से पैदा हुए बीमार बच्चों की संख्या को कम कर सकते हैं।यह एक गैर-आक्रामक तरीका है जिसे गर्भवती महिलाएं आसानी से स्वीकार कर लेती हैं।

2. रोगजनक का पता लगाना: फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर परख गोनोकोकस, क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस, माइकोप्लाज्मा सोलियम, ह्यूमन पैपिलोमा वायरस, हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस, ह्यूमन इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस, हेपेटाइटिस वायरस, इन्फ्लूएंजा वायरस, माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस, ईबीवी और साइटोमेगालोवायरस जैसे रोगजनकों के मात्रात्मक निर्धारण की अनुमति देता है।इसमें पारंपरिक परीक्षण विधियों की तुलना में उच्च संवेदनशीलता, कम नमूना आकार, तेजी और सरलता के फायदे हैं।

3. औषध प्रभावकारिता मूल्यांकन: हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) और हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि वायरल लोड और कुछ दवाओं की प्रभावकारिता के बीच संबंध है।यदि लैमीवुडीन उपचार के दौरान एचबीवी-डीएनए का सीरम स्तर कम हो जाता है और फिर फिर से बढ़ जाता है या पिछले स्तर से अधिक हो जाता है, तो यह वायरस उत्परिवर्तन का संकेत है।

4. ऑन्कोजेनेटिक परीक्षण: हालांकि ट्यूमर के विकास का तंत्र अभी तक स्पष्ट नहीं है, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि प्रासंगिक जीन में उत्परिवर्तन ऑन्कोजेनिक परिवर्तन का अंतर्निहित कारण है।कई ट्यूमर के शुरुआती चरणों में ऑन्कोजीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और उत्परिवर्तन देखा जा सकता है।वास्तविक समय प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर न केवल जीन में उत्परिवर्तन का पता लगाने में प्रभावी है, बल्कि ऑन्कोजीन की अभिव्यक्ति का सटीक रूप से पता लगा सकता है।इस पद्धति का उपयोग विभिन्न प्रकार के जीनों की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया गया है, जिसमें टेलोमेरेज़ एचटीईआरटी जीन, क्रोनिक ग्रैनुलोसाइटिक ल्यूकेमिया डब्ल्यूटी1 जीन, ऑन्कोजेनिक ईआर जीन, प्रोस्टेट कैंसर पीएसएम जीन और ट्यूमर से जुड़े वायरल जीन शामिल हैं।

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पोस्ट करने का समय: जून-21-2022